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      細胞克隆形成實驗及細胞免疫組化.doc 22頁

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      細胞克隆形成實驗 當單個細胞在體外增殖6代以上,其后代所組成的細胞群體,成為集落或克隆。每個克隆含有50以上的細胞,大小在0.3-1.0mm之間。集落形成率表示細胞的獨立生存能力。各種理化因素可能導致細胞的克隆形成能力發生改變。通過一定的實驗方法可以對細胞的克隆形成能力進行檢測。 細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數,但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞??寺⌒纬陕史从臣毎后w依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細胞生物學性狀不同,細胞克隆形成率差別也很大: 一般初代培養細胞克隆形成率弱,傳代細胞系強;二倍體細胞克隆形成率弱,轉化細胞系強;正常細胞克隆形成率弱,腫瘤細胞強。 實驗方法: 平板集落形成實驗、軟瓊脂集落形成實驗 ?(a)?平板集落形成實驗:本法適用于貼壁生長的細胞和正常培養的細胞 ?(b)?軟瓊脂集落形成實驗:本法適用于非錨著依賴性生長的細胞,如骨髓造血干細胞、腫瘤細胞株、轉化細胞系。 平板克隆形成實驗基本步驟: 1、取對數生長期的各組細胞,分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞,并把細胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養液中備用。 2、將細胞懸液作梯度倍數稀釋,每組細胞分別以每皿50、100、200個細胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預溫培養液的皿中,并輕輕轉動,使細胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養2~3周。 3、經常觀察,當培養皿中出現肉眼可見的克隆時,終止培養。棄去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞5mL固定15分鐘。然后去固定液,加適量GIMSA應用染色液染10~30分鐘,然后用流水緩慢洗去染色液,空氣干燥。 4、將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片,用肉眼直接計數克隆,或在顯微鏡(低倍鏡)計數大于10個細胞的克隆數。最后計算克隆形成率。 克隆形成率 =(克隆數/接種細胞數)×100% 平板克隆形成試驗方法簡單,適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好,不能有細胞團,接種密度不能過大。 平板克隆形成試驗方法簡單,適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好,不能有細胞團,接種密度不能過大。 軟瓊脂培養克隆形成試驗基本步驟:? (1)取對數生長期細胞,用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打,使之成為單細胞,作活細胞計數,用含20%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度至1×106細胞/L。然后根據實驗要求作梯度倍數稀釋。? (2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液,高壓滅菌后,維持在40℃中不會凝固。? (3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后,取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7~10mL),冷卻凝固,可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。? (4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養基在無菌試管中相混以后,再向管中加入0.2mL的細胞懸液,充分混勻,注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中,逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后,置入37℃ 5%CO2溫箱中培養10~14天。? (5)把平皿放置在倒置顯微鏡下,觀察細胞克隆數。計算形成率。 軟瓊脂培養法常用檢測腫瘤細胞和轉化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時,瓊脂溫度不宜超過40℃。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個,一般6cm的平皿接種1000個細胞。正常細胞在懸浮狀態下不能增殖,不適用于軟瓊脂克隆形成試驗。? 軟瓊脂集落形成率實驗(軟瓊脂克隆) ?? 將1.2%低熔點瓊脂糖與2×細胞培養基以1:1 的體積比混合制備0.6%的底層瓊脂,6 孔板中每個孔1.4ml 溫室凝固,取對數期細胞,胰酶消化后吹散成單個細胞懸液,計數,并調細胞濃度為10000 個/ml,將0.6%低熔點瓊脂糖與2×細胞培養基以1:1 的體積比混合,制備0.3%的上層瓊脂,每孔加1ml 上層瓊脂和100ul 單細胞懸液(約1000cell/well),混勻,室溫凝固。置于37℃,5%CO2 的細胞培養箱中培養2-3 周,計數含50 個細胞以上得克隆,計算細胞集落形成率,SpotII 采集圖像。 注意事項 1.接種時細胞密度適度,不可過高。 2.軟瓊脂與細胞混合時溫度不能超過40℃,否則將會燙傷/死細胞; 3.瓊脂對熱和酸不穩定,若反復加熱,容易降解而產生毒性,且硬度下降。因此高壓滅菌后應進行分裝; 4.細胞在進行克隆形成實驗時要求有95%以上的分散度,否則結果的準確度會受到很大影響; 5.細胞在低密度、非貼壁狀態條件下培養,生存率明顯下降,永生細胞系/株克

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